BDDE ڪراس-منسلڪ آٽوڪليو ۾ نئين ردعمل جي پيداوار جي ڳولا

Javascript هن وقت توهان جي برائوزر ۾ بند ٿيل آهي.جڏهن جاوا اسڪرپٽ غير فعال آهي، هن ويب سائيٽ جا ڪجهه فنڪشن ڪم نه ڪندا.
Javier Fidalgo, * Pierre-Antoine Deglesne, * Rodrigo Arroyo, * Lilian Sepúlveda, * Evgeniya Ranneva, Philippe Deprez Department of Science, Skin Tech Pharma Group, Castello D'Empúries, Catalonia, Spain * ھنن ليکڪن وٽ ھن ڪم ۾ ڪجھ بصيرت آھي برابر تعاون جو پس منظر: Hyaluronic acid (HA) ھڪڙو قدرتي طور تي موجود پوليسڪچرائڊ آھي جيڪو جمالياتي مقصدن لاءِ ڊرمل فلرز جي پيداوار ۾ استعمال ٿيندو آھي.ڇاڪاڻ ته ان جي انساني بافتن ۾ ڪيترن ئي ڏينهن جي اڌ زندگي آهي، HA-based dermal fillers کي ڪيميائي طور تبديل ڪيو ويو آهي جسم ۾ پنهنجي زندگي وڌائڻ لاء.تجارتي HA-based fillers ۾ سڀ کان وڌيڪ عام تبديلي 1,4-butanediol diglycidyl ether (BDDE) جو استعمال آھي ھڪ ڪراس لنڪنگ ايجنٽ جي طور تي HA زنجيرن کي پار ڪرڻ لاءِ.بقايا يا غير رد عمل ٿيل BDDE کي غير زهر سمجهيو ويندو آهي <2 حصن في ملين (ppm)؛تنهن ڪري، مريض جي حفاظت کي يقيني بڻائڻ لاءِ حتمي ڊرمل فلر ۾ بقايا BDDE کي مقدار ۾ رکڻ گهرجي.مواد ۽ طريقا: هي مطالعو بي ڊي ڊي اي ۽ ايڇ اي جي وچ ۾ ڪراس-لنڪنگ رد عمل جي ضمني پيداوار جي سڃاڻپ ۽ خاصيت کي بيان ڪري ٿو الڪائن جي حالتن هيٺ مائع ڪروميٽوگرافي ۽ ماس اسپيڪٽروميٽري (LC-MS) کي گڏ ڪندي.نتيجا: مختلف تجزين کان پوءِ، اهو معلوم ٿيو ته HA-BDDE هائيڊروجيل کي نيڪال ڪرڻ لاءِ استعمال ٿيندڙ الڪائن جون حالتون ۽ اعليٰ درجه حرارت هن نئين ضمني پراڊڪٽ جي ٺهڻ کي فروغ ڏنو، ”پروپيلين گلائڪول جهڙو“ مرڪب.LC-MS تجزيي جي تصديق ڪئي وئي آهي ته ضمني پراڊڪٽ ۾ ساڳيو مونوسوٽوپيڪ ماس BDDE آهي، هڪ مختلف برقرار رکڻ جو وقت (tR)، ۽ هڪ مختلف UV جذب (λ=200 nm) موڊ.BDDE جي برعڪس، LC-MS تجزيي ۾ اهو ڏٺو ويو ته ساڳئي ماپ جي حالتن ۾، هن ضمني پيداوار ۾ 200 nm تي وڌيڪ ڳولڻ جي شرح آهي.نتيجو: اهي نتيجا ظاهر ڪن ٿا ته هن نئين مرڪب جي جوڙجڪ ۾ ڪو به ايپو آڪسائيڊ ناهي.تجارتي مقصدن لاءِ HA-BDDE هائيڊروجيل (HA ڊرمل فلر) جي پيداوار ۾ مليل هن نئين ضمني پيداوار جي خطري جو جائزو وٺڻ لاءِ بحث کليل آهي.Keywords: hyaluronic acid, HA dermal filler, cross-linked hyaluronic acid, BDDE, LC-MS analysis, BDDE by-product.
hyaluronic acid (HA) تي ٻڌل فلر سڀ کان وڌيڪ عام ۽ مشهور ڊرمل فلر آهن جيڪي کاسمیٹڪ مقصدن لاءِ استعمال ڪيا ويندا آهن.1 ھي ڊرمل فلر ھڪڙو ھائڊروجل آھي، عام طور تي> 95٪ پاڻي ۽ 0.5-3٪ HA تي مشتمل آھي، جيڪو انھن کي جيل جھڙو جوڙجڪ ڏئي ٿو.2 HA هڪ پولي سيڪرائڊ آهي ۽ vertebrates جي extracellular matrix جو بنيادي جزو آهي.اجزاء مان هڪ.اهو مشتمل آهي (1,4)-گلوڪورونڪ ايسڊ-β (1,3)-N-acetylglucosamine (GlcNAc) ريپٽيٽ ڊاسڪرائڊ يونٽس جيڪي گليڪوسيڊڪ بانڊز سان ڳنڍيل آهن.هي disaccharide نمونو سڀني جاندارن ۾ ساڳيو آهي.ڪجھ پروٽين تي ٻڌل فلرز جي مقابلي ۾ (جهڙوڪ ڪوليجن)، هي ملڪيت HA کي انتهائي بايو مطابقت وارو ماليڪيول بڻائي ٿو.اهي ڀرڻ وارا امينو اسيد جي ترتيب جي خاصيت کي ظاهر ڪري سگھن ٿا جيڪي شايد مريض جي مدافعتي نظام طرفان سڃاتل هجن.
جڏهن ڊرمل فلر جي طور تي استعمال ڪيو وڃي ٿو، HA جي بنيادي حد ان جي ٽشوز جي اندر تيز رفتار ڦيرائڻ آهي ڇاڪاڻ ته انزائيمس جي هڪ مخصوص خاندان جي موجودگي جي ڪري hyaluronidases سڏيو ويندو آهي.هينئر تائين، HA جي جوڙجڪ ۾ ڪيتريون ئي ڪيميائي تبديليون بيان ڪيون ويون آهن ته بافتن ۾ HA جي اڌ زندگي کي وڌائڻ لاء.3 انھن مان گھڻا تبديليون ھائيلورونيڊس جي رسائي کي گھٽائڻ جي ڪوشش ڪندا آھن پوليسڪچرائڊ پوليمر تائين HA زنجيرن کي ڪراس ڳنڍڻ ذريعي.تنهن ڪري، پلن جي ٺهڻ جي ڪري ۽ HA ساخت ۽ ڪراس-لنڪنگ ايجنٽ جي وچ ۾ intermolecular covalent بانڊ، ڪراس سان ڳنڍيل HA هائيڊروجيل قدرتي HA جي ڀيٽ ۾ وڌيڪ اينٽي اينزيم تباهي جي پيداوار پيدا ڪري ٿو.4-6
هينئر تائين، ڪراس لنڪ ٿيل HA پيدا ڪرڻ لاءِ استعمال ٿيندڙ ڪيميائي ڪراس لنڪنگ ايجنٽن ۾ شامل آهن ميٿيڪريلامائيڊ، 7 هائيڊرازائيڊ، 8 ڪاربوڊائيمائيڊ، 9 ڊيوينائل سلفون، 1,4-بوٽانيڊيول ڊيگليسيڊيل ايٿر (BDDE) ۽ پولي (ethylene glycol) diglycidyl ether.10,11 BDDE هن وقت سڀ کان وڌيڪ استعمال ٿيل ڪراس لنڪنگ ايجنٽ آهي.جيتوڻيڪ انهن قسمن جا هائيڊروجيل ڏهاڪن تائين محفوظ ثابت ٿي چڪا آهن، استعمال ٿيل ڪراس لنڪنگ ايجنٽ رد عمل وارا ريجنٽ آهن جيڪي شايد سائٽوٽوڪسڪ ۽، ڪجهه حالتن ۾، ميوٽيجينڪ هوندا.12 تنهن ڪري، حتمي هائيڊروگل ۾ انهن جي بقايا مواد اعلي هجڻ گهرجي.BDDE محفوظ سمجهيو ويندو آهي جڏهن بقايا ڪنسنٽريشن 2 حصن في ملين (ppm) کان گهٽ آهي.4
HA هائيڊروجيلز ۾ گھٽ-ريسيڊيو BDDE ڪنسنٽريشن، ڪراس-لنڪنگ ڊگري ۽ متبادل پوزيشن کي معلوم ڪرڻ جا ڪيترائي طريقا آھن، جھڙوڪ گيس ڪروميٽوگرافي، ماس اسپيڪٽروميٽري (MS) سان گڏ ماپ خارج ڪرڻ واري ڪروميٽوگرافي، ائٽمي مقناطيسي گونج (NMR) فلوروسينس ماپ جا طريقا، ۽ ڊاءِڊ ايري ملائي اعليٰ ڪارڪردگي مائع ڪروميٽوگرافي (HPLC).13-17 هي مطالعو بيان ڪري ٿو هڪ ضمني پيداوار جي سڃاڻپ ۽ خاصيت کي حتمي ڪراس سان ڳنڍيل HA هائيڊروجيل ۾ BDDE ۽ HA جي رد عمل جي ذريعي پيدا ڪيل الڪائن جي حالتن هيٺ.HPLC ۽ مائع ڪروميٽوگرافي-ماس اسپيڪٽروميٽري (LC-MS تجزيو).جيئن ته BDDE جي هن ضمني پراڊڪٽ جي زهر نامعلوم ناهي، اسان سفارش ڪريون ٿا ته ان جي رهائش جي مقدار کي ساڳئي طريقي سان طئي ڪيو وڃي جيئن عام طور تي BDDE تي آخري پراڊڪٽ ۾ ڪيو ويندو آهي.
HA (Shiseido Co., Ltd., Tokyo, Japan) جي حاصل ڪيل سوڊيم لوڻ جو ماليڪيولر وزن ~ 1,368,000 Da (Laurent method) 18 آهي ۽ اندروني ويسڪوسيٽي 2.20 m3/kg آهي.ڪراس لنڪنگ ردعمل لاء، BDDE (≥95٪) Sigma-Aldrich Co. (سينٽ لوئس، MO، USA) کان خريد ڪيو ويو.PH 7.4 سان فاسفيٽ بفر ٿيل لوڻ Sigma-Aldrich ڪمپني کان خريد ڪيو ويو.LC-MS تجزيي ۾ استعمال ٿيل سڀ سالوينٽس، ايڪٽونٽريل ۽ پاڻي HPLC گريڊ جي معيار مان خريد ڪيا ويا.فارمڪ ايسڊ (98٪) خريد ڪيو ويو آهي ريگينٽ گريڊ جي طور تي.
سڀئي تجربا UPLC Acquity سسٽم تي ڪيا ويا (Waters, Milford, MA, USA) ۽ هڪ API 3000 ٽرپل کواڊرپول ماس اسپيڪٽروميٽر سان ڳنڍيل هڪ اليڪٽررو اسپري آئنائيزيشن ماخذ (AB SCIEX, Framingham, MA, USA) سان ليس.
198 mg BDDE کي 10% (w/w) sodium hyaluronate (NaHA) محلول ۾ 1% الڪلي (سوڊيم هائيڊروڪسائيڊ، NaOH) جي موجودگيءَ ۾ ڪراس سان ڳنڍيل HA هائيڊروجيلز جي ٺهڻ شروع ڪئي وئي.رد عمل جي مرکب ۾ آخري BDDE ڪنسنٽريشن 9.9 mg/mL (0.049 mM) هو.ان کان پوء، رد عمل جو مرکب چڱي طرح ملايو ويو ۽ هڪجهڙائي ڪئي وئي ۽ 4 ڪلاڪ لاء 45 ° C تي اڳتي وڌڻ جي اجازت ڏني وئي.19 ردعمل جو pH ~ 12 تي رکيو ويو آهي.
ان کان پوء، رد عمل جو مرکب پاڻي سان ڌوئي ويو، ۽ آخري HA-BDDE هائيڊروجيل کي فلٽر ڪيو ويو ۽ PBS بفر سان 10 کان 25 mg/mL جي HA ڪنسنٽريشن حاصل ڪرڻ لاءِ، ۽ 7.4 جي آخري pH حاصل ڪرڻ لاءِ.پيدا ٿيل ڪراس سان ڳنڍيل HA هائيڊروجيلز کي جراثيم کان پاڪ ڪرڻ لاءِ، اهي سڀ هائيڊروجيل آٽو ڪليوڊ (120°C 20 منٽن لاءِ) آهن.صاف ٿيل BDDE-HA هائيڊروجيل 4 ° C تي ذخيرو ٿيل آهي جيستائين تجزيو ڪيو وڃي.
ڪراس سان ڳنڍيل HA پراڊڪٽ ۾ موجود BDDE جو تجزيو ڪرڻ لاءِ، 240 mg جو نمونو وزن ڪيو ويو ۽ سينٽر سوراخ ۾ متعارف ڪرايو ويو (Microcon®؛ Merck Millipur، Billerica، MA, USA؛ حجم 0.5 mL) ۽ سينٽرفيوج ڪيو ويو 10,000 rpm تي ڪمري جي حرارت تي 10 منٽ.مجموعي طور تي 20 μL پل-ڊائون مائع گڏ ڪيو ويو ۽ تجزيو ڪيو ويو.
BDDE معيار جو تجزيو ڪرڻ لاءِ (Sigma-Aldrich Co) الڪائن جي حالتن هيٺ (1٪، 0.1٪ ۽ 0.01٪ NaOH)، جيڪڏهن هيٺيون شرطون ملن ٿيون، مائع نموني 1:10، 1:100، يا مٿي آهي. 1: 1,000,000 جيڪڏھن ضروري ھجي ته، استعمال ڪريو MilliQ deionized پاڻي تجزيو لاءِ.
ڪراس-لنڪنگ ردعمل ۾ استعمال ٿيندڙ شروعاتي مواد لاء (HA 2٪، H2O، 1٪ NaOH، ۽ 0.049 mM BDDE)، انهن مواد مان تيار ڪيل هر نموني جو 1 mL ساڳيو تجزيي جي حالتن کي استعمال ڪندي تجزيو ڪيو ويو.
آئن نقشي ۾ ظاهر ٿيندڙ چوٽي جي خاصيت کي طئي ڪرڻ لاء، 10 µL جو 100 ppb BDDE معياري حل (Sigma-Aldrich Co) 20 µL نموني ۾ شامل ڪيو ويو.انهي حالت ۾، هر نموني ۾ معيار جي آخري ڪنسنٽريشن 37 پي بي بي آهي.
پهريون، 10 μL معياري BDDE (Sigma-Aldrich Co) کي 990 μL MilliQ پاڻي (کثافت 1.1 g/mL) سان ملائي 11,000 mg/L (11,000 ppm) جي ڪنسنٽريشن سان BDDE اسٽاڪ حل تيار ڪريو.هي حل استعمال ڪريو 110 µg/L (110 ppb) BDDE حل تيار ڪرڻ لاءِ هڪ وچولي معياري ڊيليشن جي طور تي.ان کان پوء، 75، 50، 25، 10، ۽ 1 ppb جي گهربل ڪنسنٽريشن حاصل ڪرڻ لاءِ، وچولي ڊيلوئنٽ کي ڪيترائي ڀيرا گھٽائي معياري وکر تيار ڪرڻ لاءِ وچولي BDDE معياري ڊيلوئنٽ (110 ppb) استعمال ڪريو.جيئن ته شڪل 1 ۾ ڏيکاريل آهي، اهو معلوم ٿئي ٿو ته BDDE معياري وکر 1.1 کان 110 ppb تائين سٺي لڪير آهي (R2> 0.99).معياري وکر چار آزاد تجربن ۾ بار بار ڪيو ويو.
شڪل 1 BDDE معياري حساب ڪتاب وکر LC-MS تجزيي ذريعي حاصل ڪيو ويو آهي، جنهن ۾ هڪ سٺو تعلق ڏٺو ويو آهي (R2> 0.99).
مخفف: BDDE، 1,4-butanediol diglycidyl ether؛LC-MS، مائع ڪروماتوگرافي ۽ ماس اسپيڪٽروميٽري.
BDDE معيارن کي سڃاڻڻ ۽ مقدار ڪرڻ لاءِ ڪراس-منسلڪ ٿيل HA ۽ BDDE معيارن کي بنيادي حل ۾، LC-MS تجزيو استعمال ڪيو ويو.
ڪروميٽوگرافڪ علحدگي حاصل ڪئي وئي LUNA 2.5 µm C18(2)-HST ڪالمن (50×2.0 mm2؛ Phenomenex, Torrance, CA, USA) ۽ تجزيي دوران ڪمري جي درجه حرارت (25 ° C) تي رکيو ويو.موبائيل اسٽيج تي مشتمل آهي acetonitrile (solvent A) ۽ پاڻي (solvent B) جنهن ۾ 0.1% formic acid شامل آهن.موبائيل مرحلو گريجوئيٽ ايليوشن ذريعي ختم ڪيو ويو آهي.گريجوئيٽ هن ريت آهي: 0 منٽ، 2٪ اي؛1 منٽ، 2٪ الف؛6 منٽ، 98٪ الف؛7 منٽ، 98٪ اي؛7.1 منٽ، 2٪ الف؛10 منٽ، 2٪ A. هلندڙ وقت 10 منٽ آهي ۽ انجڻ جو مقدار 20 μL آهي.BDDE جي برقرار رکڻ جو وقت اٽڪل 3.48 منٽ آهي (تجربن جي بنياد تي 3.43 کان 4.14 منٽن تائين).موبائل مرحلو LC-MS تجزيو لاءِ 0.25 mL/min جي وهڪري جي شرح تي پمپ ڪيو ويو.
BDDE تجزيي ۽ MS پاران مقدار جي تصديق لاءِ، UPLC سسٽم (Waters) کي API 3000 triple quadrupole mass spectrometer (AB SCIEX) سان گڏ ڪيو ويو آهي جيڪو اليڪٽررو اسپري آئنائيزيشن ماخذ سان ليس آهي، ۽ تجزيو مثبت آئن موڊ (ESI+) ۾ ڪيو ويندو آهي.
BDDE تي ڪيل آئن ٽڪڙي جي تجزيي جي مطابق، سڀ کان وڌيڪ شدت سان ٽڪرا 129.1 Da (شڪل 6) سان لاڳاپيل ٽڪرا ٿيڻ جو اندازو لڳايو ويو.تنهن ڪري، مقدار جي لاءِ ملٽي آئن مانيٽرنگ موڊ (MIM) ۾، BDDE جو ماس ڪنورشن (ماس کان چارج ريشو [m/z]) 203.3/129.1 Da آهي.اهو پڻ استعمال ڪري ٿو مڪمل اسڪين (FS) موڊ ۽ پراڊڪٽ آئن اسڪين (PIS) موڊ LC-MS تجزيو لاءِ.
طريقي جي خاصيت جي تصديق ڪرڻ لاء، هڪ خالي نموني (ابتدائي موبائل مرحلو) تجزيو ڪيو ويو.203.3/129.1 Da جي وڏي تبديلي سان خالي نموني ۾ ڪوبه سگنل نه مليو.تجربا جي ورهاڱي جي حوالي سان، 55 پي بي بي جي 10 معياري انجڻ جو تجزيو ڪيو ويو (تخليق وکر جي وچ ۾)، نتيجي ۾ هڪ بقايا معياري انحراف (RSD) <5٪ (ڊيٽا نه ڏيکاريل آهي).
بقايا BDDE مواد کي 8 مختلف آٽو ڪليوڊ BDDE ڪراس-لنڊڪ ٿيل HA هائڊروگلز ۾ مقدار ۾ ڪيو ويو، چار آزاد تجربن جي مطابق.جيئن ته "مواد ۽ طريقا" سيڪشن ۾ بيان ڪيو ويو آهي، مقدار جو اندازو BDDE معيار جي گھٽتائي جي ريگريشن وکر جي اوسط قدر سان ڪيو ويندو آهي، جيڪو 203.3/129.1 Da جي BDDE ماس ٽرانزيشن تي دريافت ڪيل منفرد چوٽي سان ملندو آهي، برقرار رکڻ سان. وقت 3.43 کان 4.14 منٽ انتظار نه ڪيو.شڪل 2 10 ppb BDDE ريفرنس معيار جو مثال ڪروميٽگرام ڏيکاري ٿو.جدول 1 8 مختلف هائڊروجلز جي بقايا BDDE مواد جو خلاصو ڪري ٿو.قيمت جي حد 1 کان 2.46 پي بي بي آهي.تنهن ڪري، نموني ۾ بقايا BDDE ڪنسنٽريشن انساني استعمال لاء قابل قبول آهي (<2 ppm).
شڪل 2 Ion chromatogram of 10 ppb BDDE ريفرنس معيار (Sigma-Aldrich Co)، MS (m/z) 203.30/129.10 Da (مثبت MRM موڊ ۾) جي LC-MS تجزيي ذريعي حاصل ڪيل منتقلي.
مخفف: BDDE، 1,4-butanediol diglycidyl ether؛LC-MS، مائع ڪروميٽوگرافي ۽ ماس اسپيڪٽروميٽري؛MRM، گھڻن ردعمل جي نگراني؛ايم ايس، ماس؛m/z، ماس کان چارج تناسب.
نوٽ: نمونا 1-8 آٽو ڪليوڊ BDDE ڪراس-لنڊڪ ٿيل HA هائڊروگلز آهن.هائيڊروجيل ۾ بي ڊي ڊي جي بقايا مقدار ۽ بي ڊي ڊي جي برقرار رکڻ واري وقت جي چوٽي پڻ ڄاڻايل آهي.آخرڪار، مختلف برقرار رکڻ واري وقتن سان نون چوٽي جي وجود کي پڻ ٻڌايو ويو آهي.
مخفف: BDDE، 1,4-butanediol diglycidyl ether؛HA، hyaluronic امل؛MRM، گھڻن ردعمل جي نگراني؛tR، برقرار رکڻ جو وقت؛LC-MS، مائع ڪروميٽوگرافي ۽ ماس اسپيڪٽروميٽري؛آر آر ٽي، لاڳاپيل برقرار رکڻ جو وقت.
حيرت انگيز طور تي، LC-MS ion chromatogram جي تجزيي ڏيکاري ٿي ته سڀني آٽو ڪليڊ ڪراس سان ڳنڍيل HA هائيڊروگل نموني جي بنياد تي تجزيو ڪيو ويو، 2.73 کان 3.29 منٽ جي مختصر برقرار رکڻ واري وقت تي اضافي چوٽي هئي.مثال طور، شڪل 3 ڏيکاري ٿو آئن ڪروميٽگرام کي ڪراس سان ڳنڍيل HA نموني جو، جتي هڪ اضافي چوٽي لڳ ڀڳ 2.71 منٽن جي مختلف برقرار رکڻ واري وقت تي ظاهر ٿئي ٿي.نئين مشاهدي واري چوٽي ۽ بي ڊي ڊي اي جي چوٽي جي وچ ۾ مشاهدو لاڳاپو برقرار رکڻ جو وقت (آر آر ٽي) 0.79 (ٽيبل 1) مليو.جيئن ته اسان ڄاڻون ٿا ته LC-MS تجزيي ۾ استعمال ٿيل C18 ڪالمن ۾ نئين مشاهدي جي چوٽي گهٽ رکيل آهي، نئين چوٽي BDDE کان وڌيڪ پولر مرڪب سان ملائي سگھي ٿي.
شڪل 3 LC-MS (MRM ماس ڪنورشن 203.3/129.0 Da) پاران حاصل ڪيل ڪراس سان ڳنڍيل HA هائيڊروگل نموني جو Ion ڪروميٽگرام.
مخفف: HA، hyaluronic acid؛LC-MS، مائع ڪروميٽوگرافي ۽ ماس اسپيڪٽروميٽري؛MRM، گھڻن ردعمل جي نگراني؛آر آر ٽي، لاڳاپا برقرار رکڻ جو وقت؛tR، برقرار رکڻ جو وقت.
ان امڪان کي رد ڪرڻ لاءِ ته نئين چوٽي جو مشاهدو ڪيو ويو آهي شايد اصل ۾ استعمال ٿيل خام مال ۾ موجود آلودگي، اهي خام مال پڻ ساڳيا LC-MS تجزياتي طريقي سان تجزيو ڪيو ويو.شروعاتي مواد جو تجزيو ڪيو ويو آهي پاڻي، 2٪ NaHA پاڻيء ۾، 1٪ NaOH پاڻيء ۾، ۽ BDDE ساڳئي ڪنسنٽريشن تي ڪراس لنڪنگ رد عمل ۾ استعمال ٿيل آهن.استعمال ٿيل شروعاتي مواد جو آئن ڪروميٽگرام ڪو به مرڪب يا چوٽي نه ڏيکاريو، ۽ ان جي برقرار رکڻ جو وقت مشاهدو ڪيل نئين چوٽي سان ملندو.اها حقيقت ان خيال کي رد ڪري ٿي ته نه رڳو شروعاتي مواد ۾ اهڙا مرکبات يا مواد شامل هوندا جيڪي تجزيي جي عمل ۾ مداخلت ڪري سگھن ٿا، پر ٻين ليبارٽري شين سان ممڪن پار-آلودگي جي ڪا نشاني ناهي.BDDE جي LC-MS تجزيي کان پوءِ حاصل ڪيل ڪنسنٽريشن ويلز ۽ نيون چوٽيون ٽيبل 2 ۾ ڏيکاريل آھن (نمونہ 1-4) ۽ آئن ڪروميٽگرام شڪل 4 ۾.
نوٽ: نمونا 1-4 آٽو ڪليوڊ بي ڊي ڊي اي ڪراس سان ڳنڍيل HA هائيڊروگلز پيدا ڪرڻ لاءِ استعمال ٿيندڙ خام مال سان ملن ٿا.اهي نمونا خودڪار نه هئا.
مخفف: BDDE، 1,4-butanediol diglycidyl ether؛HA، hyaluronic امل؛LC-MS، مائع ڪروميٽوگرافي ۽ ماس اسپيڪٽروميٽري؛MRM، گھڻن ردعمل جي نگراني.
شڪل 4 HA ۽ BDDE جي ڪراس-لنڪنگ ردعمل ۾ استعمال ٿيل خام مال جي نموني جي LC-MS ڪروميٽگرام سان ملندڙ آھي.
نوٽ: اهي سڀ هڪ ئي ڪنسنٽريشن ۽ تناسب تي ماپيا ويندا آهن جيڪي ڪراس-لنڪنگ ردعمل کي انجام ڏيڻ لاءِ استعمال ڪيا ويندا آهن.ڪروميٽگرام پاران تجزيو ڪيل خام مال جا انگ ان سان ملن ٿا: (1) پاڻي، (2) 2٪ HA آبي حل، (3) 1٪ NaOH آبي حل.LC-MS تجزيو 203.30/129.10 Da (مثبت MRM موڊ ۾) جي وڏي پئماني تي تبديلي لاءِ ڪيو ويو آھي.
مخفف: BDDE، 1,4-butanediol diglycidyl ether؛HA، hyaluronic امل؛LC-MS، مائع ڪروميٽوگرافي ۽ ماس اسپيڪٽروميٽري؛MRM، گھڻن ردعمل جي نگراني.
انهن حالتن جو اڀياس ڪيو ويو جيڪي نئين چوٽي جي ٺهڻ جو سبب بڻيا.مطالعي ڪرڻ لاءِ ته ڪئين رد عمل جون حالتون پيدا ڪرڻ لاءِ استعمال ڪيون ويون ڪراس-منسلڪ HA هائيڊروجيل BDDE ڪراس-لنڪنگ ايجنٽ جي رد عمل تي اثرانداز ٿين ٿيون، نئين چوٽي جي ٺهڻ جي ڪري (ممڪن طرفان مصنوعات)، مختلف ماپون ڪيون ويون.انهن تعين ۾، اسان آخري BDDE ڪراس لنڪر جو مطالعو ۽ تجزيو ڪيو، جيڪو NaOH (0٪، 1٪، 0.1٪، ۽ 0.01٪) جي مختلف ڪنسنٽريشن سان هڪ آبي وچولي ۾ علاج ڪيو ويو، جنهن جي پٺيان يا بغير خودڪشي ڪرڻ.بيڪٽيريا جي طريقيڪار ساڳئي حالتن کي ترتيب ڏيڻ لاء ساڳيو طريقو آهي جيڪو ڪراس سان ڳنڍيل HA هائيڊروگل پيدا ڪرڻ لاء استعمال ڪيو ويو آهي.جيئن بيان ڪيو ويو آهي "مواد ۽ طريقا" سيڪشن ۾، نموني جي ڪاميٽي منتقلي جو تجزيو ڪيو ويو LC-MS پاران 203.30/129.10 Da.BDDE ۽ نئين چوٽي جي ڪنسنٽريشن جو ڳڻپ ڪيو ويو آهي، ۽ نتيجا ٽيبل 3 ۾ ڏيکاريا ويا آهن. انهن نمونن ۾ ڪا به نئين چوٽي نه ملي آهي جيڪا خودڪار نه هئي، حل ۾ NaOH جي موجودگي کان سواءِ (نمو 1-4، ٽيبل 3).خودڪشي ٿيل نمونن لاءِ، نيون چوٽيون رڳو حل ۾ NaOH جي موجودگي ۾ معلوم ٿين ٿيون، ۽ چوٽي جي ٺهڻ جو دارومدار حل ۾ NaOH ڪنسنٽريشن تي ٿئي ٿو (نمو 5-8، ٽيبل 3) (RRT = 0.79).شڪل 5 هڪ آئن ڪروميٽگرام جو هڪ مثال ڏيکاري ٿو، NAOH جي موجودگي يا غير موجودگي ۾ ٻه خودڪشي نموني ڏيکاريندي.
مخفف: BDDE، 1,4-butanediol diglycidyl ether؛LC-MS، مائع ڪروميٽوگرافي ۽ ماس اسپيڪٽروميٽري؛MRM، گھڻن ردعمل جي نگراني.
نوٽ: مٿيون ڪروميٽوگرام: نموني کي 0.1٪ NaOH آبي حل سان علاج ڪيو ويو ۽ آٽو ڪلو ڪيو ويو (120 ° C 20 منٽن لاءِ).هيٺيون ڪروميٽوگرام: نموني کي NaOH سان علاج نه ڪيو ويو، پر ساڳئي حالتن ۾ خودڪار ڪيو ويو.203.30 / 129.10 Da (مثبت MRM موڊ ۾) جي ڪاميٽي تبادلي جو تجزيو ڪيو ويو LC-MS پاران.
مخفف: BDDE، 1,4-butanediol diglycidyl ether؛LC-MS، مائع ڪروميٽوگرافي ۽ ماس اسپيڪٽروميٽري؛MRM، گھڻن ردعمل جي نگراني.
سڀني خودڪشي ٿيل نمونن ۾، NaOH سان يا ان کان سواء، BDDE ڪنسنٽريشن تمام گھٽجي ويو (16.6 ڀيرا تائين) (نمونہ 5-8، ٽيبل 2).BDDE ڪنسنٽريشن ۾ گھٽتائي ان حقيقت جي ڪري ٿي سگھي ٿي ته تيز گرمي پد تي، پاڻي بي ڊي ڊي جي ايپي آڪسائيڊ رِنگ کي کولڻ لاءِ 1,2-ڊائيل مرڪب ٺاهڻ لاءِ بيس (نيوڪلوفائل) طور ڪم ڪري سگھي ٿو.هن مرڪب جو مونوسوٽوپيڪ معيار BDDE کان مختلف آهي ۽ ان ڪري متاثر نه ٿيندو.LC-MS 203.30/129.10 Da جي هڪ وڏي شفٽ معلوم ڪئي.
آخرڪار، اهي تجربا ظاهر ڪن ٿا ته نئين چوٽي جي نسل جو دارومدار BDDE، NAOH، ۽ آٽو ڪلونگ عمل جي موجودگي تي آهي، پر HA سان ڪو به تعلق ناهي.
نئين چوٽي لڳ ڀڳ 2.71 منٽن جي برقرار رکڻ واري وقت تي مليا پوءِ LC-MS جي خاصيت هئي.هن مقصد لاءِ، BDDE (9.9 mg/mL) کي 1٪ NaOH آبي محلول ۾ داخل ڪيو ويو ۽ خودڪشي ڪئي وئي.جدول 4 ۾، نئين چوٽي جي خاصيتن جو مقابلو ڄاڻايل BDDE ريفرنس چوٽي سان ڪيو ويو آهي (ريٽرنشن ٽائيم تقريباً 3.47 منٽ).ٻن چوٽيءَ جي آئن فريگمينٽيشن جي تجزيي جي بنياد تي، اهو نتيجو ڪڍي سگهجي ٿو ته اها چوٽي 2.72 منٽن جي برقرار رکڻ واري وقت سان ڏيکاري ٿي ساڳيا ٽڪرا BDDE چوٽي وانگر، پر مختلف شدتن سان (شڪل 6).2.72 منٽن جي برقرار رکڻ واري وقت (PIS) سان لاڳاپيل چوٽي لاء، 147 Da جي ڪاميٽي تي ٽڪرائڻ کان پوء وڌيڪ شديد چوٽي ڏٺو ويو.BDDE ڪنسنٽريشن تي (9.9 mg/mL) ھن عزم ۾ استعمال ڪيو ويو، الٽراوائلٽ اسپيڪٽرم ۾ مختلف جاذب موڊس (UV, λ=200 nm) پڻ ڪروميٽوگرافڪ علحدگيءَ کان پوءِ ڏٺا ويا (شڪل 7).2.71 منٽ جي برقرار رکڻ واري وقت سان چوٽي اڃا تائين 200 nm تي نظر اچي ٿي، جڏهن ته BDDE چوٽي ساڳئي حالتن ۾ ڪروميٽگرام ۾ ڏسي نه ٿو سگهجي.
جدول 4 نئين چوٽي جي خاصيت جا نتيجا اٽڪل 2.71 منٽ جي برقرار رکڻ واري وقت سان ۽ BDDE چوٽي 3.47 منٽ جي برقرار رکڻ واري وقت سان
نوٽ: انهن نتيجن کي حاصل ڪرڻ لاء، LC-MS ۽ HPLC تجزيا (MRM ۽ PIS) ٻن چوٽي تي ڪيا ويا.HPLC تجزيي لاء، 200 nm جي موج جي ڊيگهه سان UV ڳولڻ استعمال ڪيو ويندو آهي.
مخفف: BDDE، 1,4-butanediol diglycidyl ether؛HPLC، اعلي ڪارڪردگي مائع ڪروماتگرافي؛LC-MS، مائع ڪروميٽوگرافي ۽ ماس اسپيڪٽروميٽري؛MRM، گھڻن ردعمل جي نگراني؛m/z، ماس کان چارج تناسب؛PIS، پيداوار آئن اسڪيننگ؛الٽرا وائلٽ روشني، الٽرا وائلٽ روشني.
نوٽ: ڪاميٽي جا ٽڪرا LC-MS تجزيو (PIS) ذريعي حاصل ڪيا ويا آهن.مٿين ڪروميٽگرام: BDDE معياري نموني جا ماس اسپيڪٽرم.هيٺيون ڪروميٽگرام: نئين چوٽي جو ماس اسپيڪٽرم معلوم ڪيو ويو (RRT BDDE چوٽي سان لاڳاپيل 0.79 آهي).BDDE 1٪ NaOH حل ۾ پروسيس ڪيو ويو ۽ خودڪار ٿيل.
مخفف: BDDE، 1,4-butanediol diglycidyl ether؛LC-MS، مائع ڪروميٽوگرافي ۽ ماس اسپيڪٽروميٽري؛MRM، گھڻن ردعمل جي نگراني؛PIS، پيداوار آئن اسڪين؛آر آر ٽي، لاڳاپيل برقرار رکڻ جو وقت.
شڪل 7 Ion ڪروميٽوگرام جو 203.30 Da precursor ion، ۽ (A) نئين چوٽي 2.71 منٽ جي برقرار رکڻ واري وقت سان ۽ (B) 200 nm تي 3.46 منٽ تي BDDE ريفرنس معياري چوٽي جي UV چڪاس.
سڀني ڪراس سان ڳنڍيل HA هائڊروگلز ۾ پيدا ڪيل، اهو ڏٺو ويو ته LC-MS جي مقدار کان پوء بقايا BDDE ڪنسنٽريشن <2 پي پي ايم هئي، پر تجزيي ۾ هڪ نئين نامعلوم چوٽي ظاهر ٿيو.هي نئين چوٽي BDDE معياري پيداوار سان نه ملندي.BDDE معياري پراڊڪٽ پڻ ساڳئي معيار جي تبديلي (MRM تبادلي 203.30/129.10 Da) تجزيو ڪيو آهي مثبت MRM موڊ ۾.عام طور تي، ٻين تجزياتي طريقن جهڙوڪ ڪروميگرافي کي استعمال ڪيو ويندو آهي حد ٽيسٽ جي طور تي BDDE کي هائيڊروجيلز ۾ ڳولڻ لاء، پر وڌ ۾ وڌ ڳولڻ جي حد (LOD) 2 ppm کان ٿورو گهٽ آهي.ٻئي طرف، هينئر تائين، NMR ۽ MS استعمال ڪيا ويا آهن ڪراس-لنڪنگ ۽/يا HA جي تبديليءَ جي درجي کي نمايان ڪرڻ لاءِ شگر يونٽ جي ٽڪرن ۾ ڪراس-لنڪ ٿيل HA مصنوعات.انهن ٽيڪنالاجي جو مقصد ڪڏهن به نه ڪيو ويو آهي ته بقايا BDDE جي چڪاس کي مقدار ۾ گھٽ ڪنسنٽريشن تي جيئن اسان هن مضمون ۾ بيان ڪيو آهي (اسان جي LC-MS طريقو = 10 ppb جو LOD).